Le prime notizie sulla Collegiata di Santa Giustina risalgono al XIII secolo.  Probabilmente eretta come chiesa del borgo, per contenere tutto il popolo dell’abitato, la Collegiata venne successivamente racchiusa all’interno del secondo perimetro fortificato, divenendo la chiesa principale di Mondolfo. Interamente ricostruita a seguito dei danni del terremoto dei primi del 1600, venne elevata a Colleggiata nel 1635 da Papa Urbano VIII dei Barberini. Ulteriori ampliamenti ed abbellimenti all’edificio si ebbero nel XVIII secolo, quando la chiesa raggiunse il suo aspetto attuale, venendo aperta ai fedeli nell’anno 1760. Nell’800 venne costruito il Cappellone del SS.Sacramento, dove fu posta la Madonna della Misericordia, che conserva le chiavi argentee della Città, donatele dal Comune.
L'interno spazioso e luminoso, riccamente decorato secondo lo stile barocco, contiene cinque altari laterali, oltre a quello del Cappellone, con tele dai diversi soggetti. All’Altar Maggiore la grande pala – racchiusa in una ricca cornice dorata - raffigurante la Madonna col Bambino, ed i Santi Giustina e Lorenzo; ai lati due medaglioni, con San Gerolamo e S.Maria Maddalena Mirrofora. Prezioso, nella cantoria, l’organo storico Gaetano Callido (sec. XVIII), anima di una ricca stagione concertistica annuale.