Il Museo, formatosi nel 1926, è ospitato nell'ex convento francescano, trasferitosi entro le mura di Mercatello alla metà del sec. XIII. La chiesa conserva forme di transizione tra il Romanico e il Gotico, in parte ingentilite dalle aggiunte del primo Quattrocento, come si nota nell'affresco sulla lunetta del portale con la Madonna col Bambino e i SS. Francesco e Caterina, esempio di una fiorente scuola di frescanti locali ben documentata nel museo. L'interno è a una navata con tetto a capriate e abside voltata, con affrescati sulle vele della crociera i Quattro Evangelisti attribuiti a Girolamo Genga. Le vetrate (Francesco Mossmeyer, 1912) si ispirano alla sola originale, ora musealizzata, in cui è riportata la più antica rappresentazione su vetro di San Francesco. Nella controfacciata si segnala il monumento gotico di Bartolomeo Brancaleoni, costituito da un sarcofago ornato di figure e sormontato da baldacchino, qui spostato dall'abside dove originariamente dialogava con il coevo arco trionfale (1425 c.) dominato dallo stemma di famiglia affiancato dalle statue in marmo di San Francesco e San Bonaventura. Al centro dell'arco, sulla trave, si trova un Crocifisso su tavola di Giovanni da Rimini, prima opera documentata della scuola giottesca riminese, firmato e datato 1309. All'ultimo periodo della stessa corrente pittorica appartiene invece il polittico di Giovanni Baronzio (1345 c.) posto sopra l'altare. Nella navata si notano frammenti del ciclo pittorico tardo trecentesco che ricopriva interamente le pareti e affreschi del sec. XV. Altri dipinti murali quattrocenteschi staccati da altra chiesa sono disposti lungo le pareti.

Nel Museo si conservano, tra le varie opere, tele di Giorgio Picchi e Giovan Battista Clarici (sec. XVI), Claudio Ridolfi, Giovan Francesco Guerrieri, Giovan Giacomo Pandolfi e Giovan Battista Urbinelli (sec. XVII), tavole dei toscani Bonaventura di Michele (sec. XIII) e Luca di Tommè (sec. XIV), affreschi staccati dei secoli XIV e XV, sculture lignee della scuola di Antonio Bencivenni (sec. XV), croci e oggetti liturgici dal sec. XIV al XVI e due splendidi medaglioni in marmo (1474) attribuiti a Francesco di Giorgio Martini, raffiguranti Federico duca di Urbino e Ottaviano Ubaldini conte di Mercatello. L'architetto senese lasciò altri segni della sua presenza al servizio del Duca di Urbino in alcuni edifici vicini alla sede museale, offrendo uno spunto per un itinerario di visita allargato a tutto il centro storico di Mercatello, ricco di monumenti e opere d'arte che possono essere lette e apprezzate per mezzo delle guide e audio guide predisposte dal Museo.